Com o objetivo de padronizar as condições para ensaios de atividade de fosfatases e LPS-desfosforilase, este estudo caracterizou as atividades enzimáticas em extratos hepáticos de girinos de rã-touro (Lithobates catesbeianus) no estádio 46 de desenvolvimento. Foram estabelecidos os parâmetros ótimos para a determinação da atividade p-nitrofenilfosfatásica (p-NFFásica) das fosfatases ácida e alcalina, bem como para a atividade de LPS-desfosforilase. A fosfatase ácida apresentou pH ótimo de 5,0 e temperatura ótima de 40°C, enquanto a fosfatase alcalina demonstrou pH ótimo de 10,5 e temperatura ótima de 27°C, ambas com tempo de reação de 5 minutos. A atividade de LPS-desfosforilase associada à fosfatase alcalina exibiu pH ótimo aparente de 9,0, e a estabilidade enzimática foi mantida durante o armazenamento em tampão TRIS-HCl pH 7,5. Os parâmetros estabelecidos mostram-se consistentes e comparáveis aos descritos para outros vertebrados, validando um protocolo robusto para a utilização destas enzimas como biomarcadores.